(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0-3.9mol/L为好，其pH值必须用NaOH精确调整至5.0；
(2)修饰时间应掌握在10-16h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底；
(3)反应温度应控制在50-55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好)；
(4)DNA模板量应控制在<2ug为宜。
只要遵循以上几点基本上能保证99%未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。但是，此修饰过程中模板DNA有约96%已经降解.当DNA样品较少时(如石蜡包埋组织、血清DNA)，在纯化回收时可加人适量鲑鱼精DNA或糖原(约1g)作为载体，有利于DNA沉淀(加入载体后轻轻晃动Eppendof管可见絮状DNA富集现象)。
甲基化特异PCR可能出现的问题与对策
1.引物因素分析MSP的引物设计的质量是扩增成败的关键性因素。
MSP的引物设计与普通的PCR引物设计不同，MSP的引物设计原理是：模板DNA在经过亚硫酸盐处理后，发生甲基化的基因启动子区域CpG岛内CpG位点5-端胞嘧啶保持不变；而未发生甲基化的CpG岛内CpG位点5-端胞嘧啶转化为尿嘧啶，即C-U。针对修饰前后的序列差异用MethPrimer软件设计甲基化与未甲基引物，进行PCR扩增。MSP的引物序列中至少含有1个以上CpG位点，最好是含有多个CpG位点，这样可保证引物的特异性，同时可以提高DNA启动子甲基化碱基的检出率。MSP的引物必须按亚硫酸氢钠处理后的DNA序列设计，同时也应该尽可能与普通PCR的引物设计原则相符合。按MSP的要求，任意DNA序列在做MSP扩增时，至少要合成2对引物，即甲基化引物与未甲基化引物。在MSP的未甲基化引物序列中前导引物不含鸟嘌呤碱基，反向引物不含胞嘧啶碱基。初涉及MSP者最好用文献引物进行研究。如果是为了筛选新的甲基化的抑癌基因而文献中无法找到的相应MSP引物，可用在线MethPrimer软件在线设计引物，网址为http://www.urogene.org/methprimer/index1.html.根据软件提示可以找到所需要的MSP引物。但MSP所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其CG含量相对较高，MSP扩增难度加大，因此设计好的引物最好用引物软件如Primer5.0从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率<30%的引物要进行优化，方法是：在核心启动子区域前后反复调整甲基化前导引物扩增起始点，以期使引物扩增效率增高，降低扩增难度，从而提高PCR产量。
2.MSP的反应体系问题MSP的反应体系的成分与普通PCR一样，反应体系的优化也与普通类似，反应体系的优化与普通PCR的反应体系中最大的区别是DNA模板不同。经过修饰后的模板为单链状态，MSP的DNA模板在抽提后应检测其纯度和含量，其纯度要求A260/A280在1.8-2.0之间；其含量要准确检测，否则在亚硫酸盐处理时因DNA模板加的太多而导致DNA处理不完全而导致MSP扩增失败；而加的DNA模板太少则一方面浪费试剂，另一方面会因为目的片段太少导致MSP假阴性。Mg“浓度一般在2.0-2.5mmol/L为宜，过低过高都不利于扩增。此外，PCR的缓冲液及Taq酶的来源也很重要，一般的PCR缓冲液常常会导致结果不稳定，不同来源的Taq酶也会影响结果的重复性。我们建议用Taka-ra公司针对富含CG等复杂二级结构模板的TaKaRaIATaqwithGCBuffer效果较好。而一旦选用某一厂家Taq酶后，不要轻易更换，以免MSP因重新优化而引起的时间和成本的浪费。
3.MSP的反应温度分析MSP扩增的结果有3种情况：
(1)产物电泳为阴性；
(2)产物电泳出现多条非特异性条带(含目的基因条带)；
(3)产物电泳为阳性(仅目的基因条带)。出现前2种情况时，可在保证反应体系和引物没有问题的情况下，通过调整MSP的反应温度而得到目的基因带。方法如下：PCR反应中，Tm的高低与CG含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列差异，在扩增过程中可能会出现PCR偏性。我们建议，提高预变性温度(一般应>95.C，10min)和变性温度(>95℃，1min)，退火温度以60℃作梯度或70℃作降落PCR。
总之，在MSP全过程中，影响结果的因素较普通PCR要多得多，只要对实验过程每一步认真控制可完全提高MSP的准确度和精密度。
