目录
·一、RNA酶保护试验的介绍
·二、试剂准备
·三、操作步骤
·四、电泳与放射自显影
·五、注意事项
·六、技术文档
RNA酶保护试验是通过液相杂交的方式，用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。
一、RNA酶保护试验的介绍
RNA酶保护试验（RNaseProtectionAssay，RPA）是通过液相杂交的方式，用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northernblot和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：
1.检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。
2.由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。
3.由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。
4.步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。
5.RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。
6.一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。
7.检测分子长度可以任意设置，灵活性大。
RPA的缺点是需要同位素标记探针。
二、试剂准备
1.GACUPOOL：取100mMATP.CTP.GTP各2.78μl.100mMUTP0.06μl，加DEPCH2O至100μl。
2.杂交缓冲液:PIPES0.134g.0.5MEDTA（pH8.0）20μl.5MNaCl0.8ml.甲酰胺8ml，加DEPCH2O至10ml。
3.RNase消化液：5MNaCl120μl.1MTris-HCl（pH7.4）20μl.0.5MEDTA（pH8.0）20μl.RNaseA（10mg/ml）8μl.RNaseT1（250U/μl）1μl，加DEPCH2O至2ml
三、操作步骤
（一）反义RNA制备
可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。
1.设计含T7启动子的PCR引物
由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG
引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示
2.PCR先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR产物为模板，用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR。
3.探针合成标记与纯化
在0.5ml离心管中加入下列试剂：
RNasin（40U/μl）0.5μl
GACUPOOLGAC
（含GTP.CTP.ATP各2.75mM，UTP61μM）2μl
[α-32P]UTP（10μCi/μl）2.5μl
DTT（二硫苏糖醇，0.1M）1μl
5×转录buffer2μl
模板（50ng/μl）1μl
T7RNA聚合酶（15U）1μl
混合后，短暂离心，37℃保温1hr。
加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl，37℃15min，然后75℃10min以灭活DNAseⅠ和T7RNA聚合酶。
加入：饱和酚50μl
氯仿50μl
酵母tRNA（2μg/μl）4μl
DEPCH2O100μl
室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml离心管中，再加入3MNaAc10μl，预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20℃静置30min。4℃离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4℃离心13500g×2min，弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。
（二）杂交
1.RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。
2.取8μlRNA加入1-3μl探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml离心管中。
3.80℃保温2min，然后40-45℃下杂交12-18hr。
（三）消化
1.杂交管于37℃保温15min，加入RNase消化液，37℃保温30min。
2.加入10%SDS10μl.10μg/μl蛋白酶K20μl，混匀，37℃保温10min。
3.加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。
4.转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3MNaAc15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20℃30min，4℃离心，135000g×10min。
5.弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。
四、电泳与放射自显影
（一）配制凝胶：（50ml）
40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1）6.25ml
5×TBE10ml
尿素24g
加H2O至50ml
溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。
（二）预电泳（50ml）
以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50℃。待胶板温度达50℃时，暂停电泳，准备加样。
（三）加样
将已溶解在加样缓冲液中的样品80℃加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。
（四）电泳结束
电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70℃曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影.定影.水洗.晾干。
五、注意事项
1.本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。
2.RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。
3.同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。
4.RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。
