DEAE-纤维素提取法纯化多克隆抗体

   日期:2019-04-30     来源:食品伙伴网    浏览:3    
核心提示:该法提取IgG简便,既可小量提取,也可大量制备。
  该法提取IgG简便,既可小量提取,也可大量制备。

  1.批量提取法称取DEAE-纤维素(DE32或DE52)50g,置于1000ml烧杯中,先以蒸馏水漂浮除去细颗粒,再经酸碱处理后,用0.01~0.05mol/L,pH8.0左右的磷酸盐缓冲液(PB)平衡。将水分抽干,或用布氏滤斗(内放两层滤纸)过滤,收集湿纤维素,以降低其离子强度。按1ml血清加湿重5gDEAE纤维素,经过充分搅拌,置4℃吸附1h。上清液可再如此处理一次,即获得较纯的IgG。该法提取IgG简便,既可小量提取,也可大量制备。

  2.Tris-Cl离子交换层析法(Ion-exchangechromatography)

  【材料和试剂】

  (1)DE32或DE52纤维素。

  (2)HCl;NaOH;0.01~0.05mol/L,pH8.0PB;0.01mol/L,pH8.6Tris-Cl;0.5mol/LNaCl。

  (3)待纯化标本:杂交瘤腹水或培养上清,免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。

  (4)1.5×50cm层析柱;透析袋;紫外分光光度计及其他透析和层析所需的试剂和器材。

  【操作步骤】

  (1)DE52纤维素的处理:DE52经酸、碱处理,0.01mol/L,pH8.6Tris-Cl平衡。

  (2)装柱:将层析柱固定于滴定架上,柱底垫一圆形尼龙纱,出口接一细塑料管并关闭出水。将浸泡于0.01mol/L,pH8.6Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中,待DE52自然沉降3~5cm高时,吸除0.01mol/L,pH8.6Tris-Cl,或松开出水口螺旋夹,控制流速1~2ml/min,同时连续加入DE52至所需高度。待DE52完全沉降后,柱面放一圆形滤纸片。

  (3)平衡:松开出水口螺旋夹,以0.01mol/L,pH8.6Tris-Cl平衡,控制流速为15滴/min,待流出液与洗脱液之pH值达到一致时,停止平衡。

  (4)待提取样品的准备:将蛋白装入透析袋里,置4℃冰箱,对0.01mol/LpH8.6Tris-Cl透析过夜。

  (5)加样、洗脱与收集:用吸管吸去柱面液体,以毛细吸管沿柱壁加入样品,样品体积相当于柱床体积的1%~2%,蛋白浓度为50~70mg。启开出水口螺旋夹使样品缓慢进入柱床内,并用少量洗脱液清洗柱壁;待液体进入柱床后,以0.01mol/L,pH8.6Tris-Cl洗脱,控制流速为14~16滴/min。分部收集器收集,紫外监测,或人工收集,以紫外分光光度计分别测定每管280nmOD值,描绘洗脱液峰。

  (6)浓缩:将洗脱液的280nmOD上峰段与下峰段各管分别合并,装入透析袋,以PEG浓缩至所需体积。

  3.Tris-PO4离子交换层析法

  该法在上述方法的基础上稍加改良,即通过梯度洗脱,可用于血清中IgG和IgM的提取。

  【材料和试剂】

  (1)DE32或DE52纤维素。

  (2)待纯化标本:杂交瘤腹水或培养上清,免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。

  (3)1.5×50cm层析柱;透析袋及其他透析和层析所需的试剂和器材。

  (4)梯度洗脱液包括:0.005mol/L,pH8.6Tris-PO4;0.055mol/L,pH6.0Tris-PO4;.5mol/L,pH5.1Tris-PO4。

  【操作步骤】

  (1)蛋白标本对0.005mol/L,pH8.6Tris-PO4透析。

  (2)DE52装柱,并以0.005mol/L,pH8.6Tris-PO4平衡。

  (3)加样,以0.005mol/L,pH8.6Tris-PO4洗脱,紫外监测直至洗脱液280nmOD回到基线。这一步骤可除去血清中其他蛋白。

  (4)以350ml0.055mol/L,pH6.0Tris-PO4洗脱,这一步骤可用于纯化血清IgG和IgM。

  (5)以125ml0.055mol/L,pH6.0Tris-PO4和125ml0.5mol/L,pH5.1Tris-PO4梯度洗脱,总量收集250ml;重复步骤(5)。

  (6)根据280nm峰值合并蛋白峰,透析浓缩和保存同上。

  用过的DE52可用0.01mol/L,pH8.6Tris-Cl和0.5mol/LNaCl、0.01mol/L,pH8.6Tris-Cl梯度洗脱回收。再用蒸馏水洗至中性,加入0.02%叠氮钠于4℃保存备用。
 
日期: 2019-04-30
标签: IgG 提取法 DEAE E 纤维
 
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