2020年5月20日消息，近日，中国科学院深圳先进技术研究院研究员郑炜团队、北京大学教授施可彬团队合作，研制出首台短波长（520纳米）激发的双光子显微系统。该系统可用于毛细血管的高分辨率、无标记、无创活体成像，相关成果论文In vivo label-free two-photon excitation autofluorescence microscopy of microvasculature using a 520 nm femtosecond fiber laser发表在Optics Letters上。

       对微血管网络在其自然环境中进行形态评估，为理解感染、高血压、糖尿病、缺血、癌症等各种疾病的发生和发展提供了独特视角。目前，无需标记物的高分辨率三维成像技术的缺乏，限制了对微血管的体内研究。以往采用蓝宝石激光器（波长范围：700-1000纳米）作为光源的普通双光子显微系统给血管成像时，由于血管自身几乎不发荧光，需要提前在血管中注射荧光染料。

       近年来，科研人员发现红细胞在可见光飞秒激光激发下可发出微弱的自发荧光信号。但以往研究只能依赖蓝宝石激光器和光参量振荡及放大技术或光子晶体光纤（PCF）产生超连续谱这两种方法来获得可见光波段（400-700纳米）的飞秒光。这些方法存在激光器体积大，价格昂贵，结构复杂，易受环境影响等问题。

       该研究借助施可彬团队自行研制的520纳米高功率飞秒光纤激光器，采用短波长激发和荧光寿命成像相结合的技术，实现了毛细血管的无标记、活体、高分辨成像。整个双光子显微系统横向分辨率达到260纳米，纵向分辨率为1.3微米，在体成像深度可达200微米。该设备的研发将为后续血管相关的疾病机理研究与治疗策略探索提供重要工具。
       该研究得到国家自然科学基金、广东省自然科学基金等项目支持。


       关于荧光显微成像技术

       荧光是当分子受到光激发时，电子从基态跃迁到不稳定状态的激发态，电子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态并发出辐射的光。荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。

       受到光激发的分子，电子从基态跃迁到激发态，电子在吸收光的能量后，可能到达第一激发态的高振动能级或第二激发态，这个时候电子会经历内转换或驰豫振荡过程到达第一激发态的最低振动能级。由于激发态是不稳定状态，电子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态并发出辐射。

       荧光光谱具有三个特点：发射光谱与激发能无关；镜像规则：发射光谱通常是吸收光谱的镜像；斯托克斯位移：与荧光发射跃迁相关的能量通常小于吸收能量。