BTN70602 DNA快速连接试剂盒说明书

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BTN70602 DNA快速连接试剂盒说明书

产品编号:BTN70602

规格:30T/100T

产品及特点

DNA 连接反应通过T4 连接酶催化双链DNA 的3'-OH 和5'-P 形成磷酸二脂键而将DNA共价连接在一起。被连接的DNA末端可以是粘末端(例如限制性切割EcoR I 产生的末端),也可以是平末端(限制性切割Sma I产生的末端)。Pheiffer 等人发现PEG 可以促进T4 DNA 连接酶催化的连接反应[NAR, 11, 7853-7871, 1983],连接反应只需十分钟即可完成。

本产品就是根据这一原理设计,其特点如下:

1. 超快,整个连接反应只需要室温5 分钟左右,反应液可以直接用于转化实验。

2. 高效,溶液配方经过优化,每ug 插入DNA 连接转化得到的重组子可达107左右。

3. 既可用于平末端连接,也可用于粘末端连接,包括PCR 产物与T 载体的连接。

4. 简单,客户只需要提供载体和插入片段即可。

格及成分:

成分

30T

100T

溶液A

150μl

500μl

溶液B

30μl

100μl

说明书

1份

1份

保存条件:

低温运输,-20℃保存,有效期一年。

使用方法:

: 连接反应

1. 在无菌的离心管中严格按下表顺序加入列各成分(以10 μL 体系为例):

成分

阴性对照管

样品管

溶液A

5μl

5μl

插入片段(自备)

-

0.2-0.5μg(注)

载体(自备)

50ng

50ng

无菌水

补水到L

补水到L

: 插入DNA 片段的摩尔数zui好是载体的3-10 倍,如果载体长度为3000bp,则所需插入DNA 片段折合成重量(ng) = (插入DNA片段bp 数×50 ng×N)÷3000 bp。N就是自己选定的插入DNA片段与载体的摩尔比。

2. zui后在每管中加入1 μL 溶液B,轻柔吹打混合均匀后用微量离心机将液体全部甩到管底。

3. 室温放置至少5 分钟,zui长可以放置过夜。

4. 70℃保温10 分钟。此步可以灭活有关的酶,否则转化效率有所降低。

5. 根据使用的转化方法,每管各取适量用于转化实验,余下的放置在-20℃保存。

二:细菌转化及筛选(仅供参考,本产品不提供相关试剂)

6. 将100 μL 转化效率在1×108 cfu/μg 以上的感受态细胞于冰上解冻。

7. 取5-10 μL 连接产物加入到感受态细胞中,轻轻旋转几次以混匀。

8. 在冰上放置30 分钟。

9. 将离心管放42℃热休克90 秒,然后快速将其转移到冰浴中放置1~2分钟。

10. 每管中加900 μL LB 培养基,37℃振荡培养1 小时复苏细胞。

11. 将100 μL 复苏涂布到含Amp 的LB 琼脂平板上(根据载体情况也可能需要加上X-gal 和IPTG)。

12. 室温4,000 rpm 离心剩余的900 μL 复苏细胞5 分钟,弃去800μL上清,用剩余100 μL 培养基重悬细胞并涂布到含Amp 的LB 琼脂平板上(可加X-gal、IPTG)。

13. 将平板置于室温直至液体被吸收。此步非常重要,否则培养板将在37℃排除水分,细菌将随水在培养基上到处游动,不能形成单个菌落。

14. 倒置平皿,于37℃培养,12~16 小时后可出现菌落。一般情况下阳性对照组会有上千个菌落(100 μL 转化液产生的菌落数×10),自联对照只有少数几个菌落,样品组的菌落数取决于PCR 回收片段的质量。

15. 按常规方法筛选重组子。

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日期: 2019-08-09
标签: 试剂盒 产品 特点 催化 磷酸
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