BTN70606 一站式miRNA尿素-PAGE电泳套装说明书

日期:2019-08-09     浏览:45    下载:0     体积:80.84K    
BTN70606 一站式miRNA尿素-PAGE电泳套装说明书

产品编号:BTN70606
 

规格:30T
 

产品及特点

尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea PAGE)是目前分离200 nt以下的小片段RNA,尤其是20 nt左右的microRNA(miRNA)分子的主要方法,但是单独配制各种溶液十分繁琐,为此我们公司开发了本产品。它具有下列特点:

1. 一站式,含有电泳所需要的所有试剂,即开即用,十分方便,免去了实验人员称取有毒物品。

2. 灵活,可以根据需要配制各种浓度的Urea-PAGE,以便对长度各异的RNA进行电泳。

3. 电泳后可直接用于UV观察、银染、胶回收、Northern杂交和放射自显影等。

4. 使用新型缓冲液,可以防止甘油的干扰。
 

规格及成分:

成分

规格

尿素

210g

丙烯酰胺

60g

甲叉双丙烯酰胺

3g

TBE电泳液, 10×

250ml

TEMED

1.5ml

过硫酸铵(干粉)

1g

miRNAON

10ml

miRNA Marker

30次

固相RNase清除剂

250ml

说明书

1份


保存条件:

常温运输、4℃保存(miRNAon、miRNA Marker需要-20°C保存)。保存期为一年。
 

自备试剂:

miRNA样品、RNase-free水。
 

使用方法

1. 准备工作:用固相RNase清除剂清洁工作平台直接将固相RNase清除剂原液或10倍的新鲜稀释液喷于台面,5分钟后用普通吸水纸擦净,zui后用沾有固相RNase清除剂1000倍新鲜稀释液的吸水纸擦净,晾干。

2. 准备工作:用固相RNase清除剂清洁玻璃和塑料器皿将器皿浸泡在固相RNase清除剂的10或100倍的新鲜稀释液中,静置处理5分钟后取出,再用固相RNase清除剂1000倍或10000倍新鲜稀释液浸泡二次以上,倒立晾干后备用。

3. 配制1×TBE电泳液: 将适量的10×TEB电泳液用RNase-free水稀释10倍,得到1×TBE电泳液待用。此溶液需要现用现配,否则易长菌。

4. 配制10%过硫酸铵溶液: 准确称取约100 mg过硫酸铵到一干净的1.5mL离心管中,按每 1 mg 过硫酸铵加10μL RNase-free水的比例加入RNase-free水,摇晃溶解待用。10%过硫酸铵溶液有效期不要超过一周。

5. 估计所需要的凝胶溶液的体积,一般配制一块13cm×15cm×0.8mm的胶需要15mL凝胶溶液,配制一块36cm×45cm×0.8mm的胶需要120mL凝胶溶液。

6. 配制 40%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液:将 3g 甲叉双丙烯酰胺加入到装有60g丙烯酰胺干粉的瓶中,再加入130 mL RNase-free水,充分摇晃混匀即得40%的Acrylamide/Bis溶液。

7. 根据所需要的凝胶溶液的体积,在一的干净的三角瓶中按下表加入各成分(此处以配制100mL Acrylamide/Bis终浓度为15%的凝胶为例):

成分

终浓度

用量

尿素

7M

42g

40% Acrylamide/Bis溶液

15%

37.5mL

10×TEB电泳液

10ml

补RNase-free水到100mL

: Acrylamide/Bis的终浓度需要根据待分离RNA长度选择(见下表)。

需分离的RNA长度范围

Acrylamide/Bis工作浓度

6-100 nt

20%

25-150 nt

15%

40-200 nt

12%

60-400 nt

8%

80-500 nt

5%

1000-2000 nt

3.5%

8. 搅拌并加热到40-50℃左右,直到尿素完全溶解。

9. 冷却到室温后,将三角瓶接上真空系统抽真空处理10-15分钟以充分去除溶液中的氧气(氧气会降低聚合反应效率)。若条件有限,此步可省略。

10. 边摇晃溶液变加入50μL TEMED和 500μL 10%过硫酸铵。注意:如果选择其他工作浓度的 Acrylamide/Bis,此二成分的用量不需要随之改变。

但如果配置的凝胶溶液的体积变化,此二成分的用量要按比例改变。

11. 再充分摇晃约 30 秒后迅速灌胶,然后插入样品梳,室温放置 30-60 分钟等待胶凝固。

12. 将凝胶板放置在电泳装置上后,在上下层分别加入适当量的 1×电泳缓冲液。如果不马上使用,需要有湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。

13. 拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液,充分将每个加样空中未聚合的Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。

14. 在上样前,预电泳20-30分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样空,同时还可以使凝胶的温度升高(到 50℃左右),有利于 RNA 变性状态。

15. 将 miRNA 样品与等体积的miRNAon混合,70℃保温 2-3分钟后迅速放置在冰上冷却,快速离心半分钟,放冰上待用。miRNA Marker 需要每个上样孔用 5μL,一块胶zui好在两侧各用一个孔上样miRNA Marker。

16. 关电泳仪后开始上样。

17. 重开电泳仪,对13 cm×15 cm的胶,以20-30mA的电流电泳,直到红色染料移动到凝胶边缘为止;对36cm×45cm的胶,则以50-60mA的电流电泳,直到红色染料移动到凝胶边缘为止。

18. 染色观察:将凝胶一面的玻璃板揭开,直接用仍然附着在另一玻璃板上的凝胶进行各种染色,包括银染(固定、漂洗、显影和定影等步骤)、EB(每100mL 1×TBE中加20μL 10mg/mL 的EB溶液)、天泽基因低毒核酸染料DNAgreen(每100 mL 1×TBE 中加10μL DNAgreen原液)。UV下观察并拍照。

19. miRNA回收:按上法用EB等染料染色后,UV下确定所需要的miRNA条带的位置,切胶后进行胶回收处理。

20. Northern 杂交:按上法用EB等染料染色后,UV下确定所需要的miRNA条带的位置,切胶后电转移到带正电的尼龙膜上,然后进行杂交处理。

21. 放射自显影:如果miRNA样品电泳前经过同位素标记,则将凝胶一面的玻璃板揭开,用滤纸将附着在另一玻璃板上的凝胶吸附过来,然后包上保鲜膜,真空抽干,然后使胶跟X光片向对置进行放射自显影。

免责声明
中实仪信网资料中心属于实验室仪器行业技术交流的非赢利性网站,本站的所有相关资料,都来自于网络和实验室同行,本站对此不承担任何技术及版权问题;
如本站有相关内容侵权,请通知我们,中实仪信网联系。联系邮箱:office@anmiya.com 联系QQ:
在本站下载的所有相关资料只作为实验室仪器同行的交流学习之用,请在下载后24小时内删除,勿作他用。正式场合使用请购买正版。否则由此产生的一切后果自行承担。
本站不保证文件的准确性和完整性,如因使用本站文件造成损失,本站不承担任何责任。
日期: 2019-08-09
标签: 产品 特点 丙烯 配制
相关资料
本类推荐
下载排行
新手指南
采购商服务
供应商服务
交易安全
关注我们
中实仪信会员交流群

0535-6611163

周一至周五 9:00-18:00
(其他时间联系在线客服)

24小时在线客服