产品编号：BTN70606
规格：30T
产品及特点：
尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea PAGE)是目前分离200 nt以下的小片段RNA，尤其是20 nt左右的microRNA(miRNA)分子的主要方法，但是单独配制各种溶液十分繁琐，为此我们公司开发了本产品。它具有下列特点:
1. 一站式，含有电泳所需要的所有试剂，即开即用，十分方便，免去了实验人员称取有毒物品。
2. 灵活，可以根据需要配制各种浓度的Urea-PAGE，以便对长度各异的RNA进行电泳。
3. 电泳后可直接用于UV观察、银染、胶回收、Northern杂交和放射自显影等。
4. 使用新型缓冲液，可以防止甘油的干扰。
规格及成分：
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成分 |
规格 |
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尿素 |
210g |
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丙烯酰胺 |
60g |
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甲叉双丙烯酰胺 |
3g |
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TBE电泳液, 10× |
250ml |
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TEMED |
1.5ml |
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过硫酸铵（干粉） |
1g |
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miRNAON |
10ml |
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miRNA Marker |
30次 |
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固相RNase清除剂 |
250ml |
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说明书 |
1份 |
保存条件：
常温运输、4℃保存（miRNAon、miRNA Marker需要-20°C保存）。保存期为一年。
自备试剂：
miRNA样品、RNase-free水。
使用方法：
1. 准备工作：用固相RNase清除剂清洁工作平台直接将固相RNase清除剂原液或10倍的新鲜稀释液喷于台面，5分钟后用普通吸水纸擦净，zui后用沾有固相RNase清除剂1000倍新鲜稀释液的吸水纸擦净，晾干。
2. 准备工作：用固相RNase清除剂清洁玻璃和塑料器皿将器皿浸泡在固相RNase清除剂的10或100倍的新鲜稀释液中，静置处理5分钟后取出，再用固相RNase清除剂1000倍或10000倍新鲜稀释液浸泡二次以上，倒立晾干后备用。
3. 配制1×TBE电泳液: 将适量的10×TEB电泳液用RNase-free水稀释10倍，得到1×TBE电泳液待用。此溶液需要现用现配，否则易长菌。
4. 配制10%过硫酸铵溶液: 准确称取约100 mg过硫酸铵到一干净的1.5mL离心管中，按每 1 mg 过硫酸铵加10μL RNase-free水的比例加入RNase-free水，摇晃溶解待用。10%过硫酸铵溶液有效期不要超过一周。
5. 估计所需要的凝胶溶液的体积，一般配制一块13cm×15cm×0.8mm的胶需要15mL凝胶溶液，配制一块36cm×45cm×0.8mm的胶需要120mL凝胶溶液。
6. 配制 40%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液：将 3g 甲叉双丙烯酰胺加入到装有60g丙烯酰胺干粉的瓶中，再加入130 mL RNase-free水，充分摇晃混匀即得40%的Acrylamide/Bis溶液。
7. 根据所需要的凝胶溶液的体积，在一的干净的三角瓶中按下表加入各成分（此处以配制100mL Acrylamide/Bis终浓度为15%的凝胶为例）:
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成分 |
终浓度 |
用量 |
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尿素 |
7M |
42g |
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40% Acrylamide/Bis溶液 |
15% |
37.5mL |
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10×TEB电泳液 |
1× |
10ml |
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补RNase-free水到100mL |
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注: Acrylamide/Bis的终浓度需要根据待分离RNA长度选择(见下表)。
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需分离的RNA长度范围 |
Acrylamide/Bis工作浓度 |
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6-100 nt |
20% |
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25-150 nt |
15% |
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40-200 nt |
12% |
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60-400 nt |
8% |
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80-500 nt |
5% |
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1000-2000 nt |
3.5% |
8. 搅拌并加热到40-50℃左右，直到尿素完全溶解。
9. 冷却到室温后，将三角瓶接上真空系统抽真空处理10-15分钟以充分去除溶液中的氧气（氧气会降低聚合反应效率）。若条件有限，此步可省略。
10. 边摇晃溶液变加入50μL TEMED和 500μL 10%过硫酸铵。注意：如果选择其他工作浓度的 Acrylamide/Bis，此二成分的用量不需要随之改变。
但如果配置的凝胶溶液的体积变化，此二成分的用量要按比例改变。
11. 再充分摇晃约 30 秒后迅速灌胶，然后插入样品梳，室温放置 30-60 分钟等待胶凝固。
12. 将凝胶板放置在电泳装置上后，在上下层分别加入适当量的 1×电泳缓冲液。如果不马上使用，需要有湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。
13. 拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液，充分将每个加样空中未聚合的Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。
14. 在上样前，预电泳20-30分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样空，同时还可以使凝胶的温度升高（到 50℃左右），有利于 RNA 变性状态。
15. 将 miRNA 样品与等体积的miRNAon混合，70℃保温 2-3分钟后迅速放置在冰上冷却，快速离心半分钟，放冰上待用。miRNA Marker 需要每个上样孔用 5μL，一块胶zui好在两侧各用一个孔上样miRNA Marker。
16. 关电泳仪后开始上样。
17. 重开电泳仪，对13 cm×15 cm的胶，以20-30mA的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止；对36cm×45cm的胶，则以50-60mA的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止。
18. 染色观察：将凝胶一面的玻璃板揭开，直接用仍然附着在另一玻璃板上的凝胶进行各种染色，包括银染（固定、漂洗、显影和定影等步骤）、EB（每100mL 1×TBE中加20μL 10mg/mL 的EB溶液）、天泽基因低毒核酸染料DNAgreen（每100 mL 1×TBE 中加10μL DNAgreen原液）。UV下观察并拍照。
19. miRNA回收：按上法用EB等染料染色后，UV下确定所需要的miRNA条带的位置，切胶后进行胶回收处理。
20. Northern 杂交：按上法用EB等染料染色后，UV下确定所需要的miRNA条带的位置，切胶后电转移到带正电的尼龙膜上，然后进行杂交处理。
21. 放射自显影：如果miRNA样品电泳前经过同位素标记，则将凝胶一面的玻璃板揭开，用滤纸将附着在另一玻璃板上的凝胶吸附过来，然后包上保鲜膜，真空抽干，然后使胶跟X光片向对置进行放射自显影。
