BTN60905 MMLV逆转录酶说明书

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BTN60905 MMLV逆转录酶说明书

产品编号:BTN60905

规格:10000U/50000U

产品及特点

该酶是突变型的MMLV 逆转录DNA 聚合酶,从表达Moloney Murine Leukemia Virus (莫洛尼氏鼠白血病病毒)reverse transcriptase 基因(pol 基因)的E.coli 细胞中分离纯化而得,由一个分子量为76.1 KDa 的单亚基组成,可催化以单链DNA、RNA 或DNA:RNA 杂交链为模板的互补DNA 链的聚合反应。跟野生型相比,它没有RNase H 活性。

1. 延伸性能好,可合成长达12.5 Kb 的fμLl-length cDNA。

2. zui佳反应温度为42℃,但在50℃时仍然有活性,70℃10 分钟能使其失活。

3. 能以Cy3-,Cy5-,rhodamine-, aminoallyl-,fluorescein 等标记的nucleotides 为底物。

4. 可用于first strand cDNA 合成,second strand cDNA 合成,DNA labeling,RNA primer extension 等。

5. 与PCR 兼容,RT 产物可以用于PCR 和real-time PCR。

6. 能被金属螯合剂,无机磷酸,焦磷酸和多胺抑制。

7. 没有RNase H 活性。

格及成分:

成分

10000U

50000U

MMLV 逆转录酶 (200 U/μL)

50μl

50μl×5

5×RT Buffer

1ml

1ml×5

说明书

1份

1份

保存条件:

低温运输,-20℃保存,有限期一年。

使用方法:

一:合成PCR 用的1st-strand cDNA

1. 按下表配制RT 反应体系:

RNA

模板

总RNA

100-500 ng

或poly(A) mRNA

10-500 ng

或专一的RNA

0.01pg-500ng

注意:RNA 样品不能有基因组DNA污染。

 

 

引物

Oligo (dT)18(0.5ug/μL)

μL

或随机引物(0.2ug/μL)

μL

或RNA 模板专一性引物

15-20pmol

注意:随机引物于RNA 模板的比例跟zui后得到的cDNA 的平均长度成反比。

RNase-free 水     补水到12 μL

2. 70℃保温5 分钟后立即冰浴。

3. 严格按下表顺序加入各成分:

5×RT Buffer

μL

RNase Inhibitor (20U/μL)

μL

dNTP (10 mM each)

μL

4. 37℃保温5 分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板,可以改成45℃保温5 分钟。如果使用随机引物,则保温温度只能是25℃(5 分钟)。

5. 加入1 μL (=200 U) MMLV 逆转录酶,反应终体积为20μL。

6. 42℃保温60 分钟(但如果使用随机引物,需要先25℃保温10 分钟,然后再转移到42℃保温60 分钟)。

7. 70℃保温10 分钟以终止反应,放置在冰上待用。合成的cDNA 可以直接作为PCR 模板使用,不需要纯化。

二:合成建文库用的1st-strand cDNA

1. 按下表配制RT 反应体系:

RNA

模板

或poly(A) mRNA

1 ug

或专一的RNA

0.5-1ug

注意:RNA 样品不能有基因组DNA污染。

引物

Oligo (dT)18(0.5ug/μL)

μL

或随机引物(0.2ug/μL)

μL

或RNA 模板专一性引物

100pmol

注意:随机引物于RNA模板的比例跟zui后得到的cDNA 的平均长度成反比。

RNase-free 水    补水到12 μL

2. 70℃保温5 分钟后立即冰浴。

 

 

 

3. 严格按下表顺序加入各成分:

5×RT Buffer

μL

RNase Inhibitor (20U/μL)

μL

dNTP (10 mM each)

μL

4. 37℃保温5 分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板,可以改成45℃保温5 分钟。如果使用随机引物,则保温温度只能是25℃(5 分钟)。

5. 加入1 μL (=200 U) MMLV 逆转录酶,反应终体积为20μL。

6. 42℃保温60 分钟(但如果使用随机引物,需要先25℃保温10 分钟,然后再转移到42℃保温60 分钟)。

7. 70℃保温10 分钟以终止反应,放置在冰上待用。合成的cDNA 可以用于第二链cDNA 的合成或放置在-20℃。

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日期: 2019-08-14
标签: 产品 特点 病毒 分子量 催化
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