产品编号：BTN50901
规格：50T
产品及特点：
菌落PCR 是筛选重组子的有效方法，可以使质粒鉴定过程从两天缩短到几小时。但由于它直接以E.coli 菌落为PCR 而菌落中常常含有未进入细菌的、来源于连接反应的载体DNA 和插入片段，所以十分容易产生假阳性。本产品针对此缺点进行了改良，具有下列特点：
1. 无假阳性率，特殊的溶菌方式能有效降低菌落中未转化DNA 对PCR的干扰，使假阳性率低于5%，远低于绝大部分同类产品。
2. 简单快速，用户只需要提供PCR 引物和E.coli 菌落，不需要细菌培养和质粒提取,整个筛选过程从一天缩短到2-3 小时，节约时间和成本。本产品与常用E.coli 菌株和载体兼容。既可小规模筛选，也适用于大规模筛查。
3. 高灵敏度，既可用于高拷贝质粒，也适合于低拷贝质粒。
4. PCR 反应体系中含有惰性电泳染料，反映完成后可直接上样电泳，不需另加上样液。
5. 处理过的菌落样品低温长期保存后仍能用于PCR 筛查。
6. 性价比高，价格跟质粒提取试剂盒相当，但节约一天时间。
格及成分：
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成分 |
规格 |
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溶菌液A |
0.5ml |
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溶菌液B |
0.1ml |
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PCR 2.0 |
0.75ml |
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说明书 |
1份 |
保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
使用方法：
1. 标记1.5 mL 塑料离心管，除样品管外，还必须加上阳性和阴性对照管。
在每个管中加入下列成份配制100 μL 溶菌液：
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H2O(自备) |
88μl |
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溶菌液A |
10μl |
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溶菌液B |
2μl |
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合计 |
100μl |
2. 用无菌牙签或无菌移液枪头从培养皿上挑取一个菌落或部分菌落，放入溶菌液中，充分震荡直到菌落彻底分散混匀。为方便回查，zui好在培养皿上给已取样的菌落做好标记。
3. 重复第2 步直到待筛查菌落全部转移到相应的离心管中。
4. 在阳性对照管中，加入已知含有待筛选质粒的菌落；如果没有此菌落，直接进入第6 步，用连接反应液直接作PCR 的阳性对照。
5. 在阴性对照管中，加入已知的不含有待筛选质粒的任何E.coli 菌落(如常见的宿主细菌)，其他处理同第2 步。
6. 将所有离心管置于37℃保温30 分钟，然后转入100℃水浴处理10分钟。振荡混匀溶液数秒后10,000 g 离心1 分钟，转移上清到一新的离心管中待用。此溶液为样品DNA 溶液。
7. 标记与第1 步数量相同的PCR 管，每个管中分别加入下列成份并充分混匀：
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样品DNA溶液 |
1-5μl |
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PCR MagicMix |
15μl |
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引物1(10 pmol/μL) |
1μl（自备） |
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引物2(10 pmol/μL) |
1μl（自备） |
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Taq 物DNA聚合酶(5U/μL) |
0.2-0.4μL(1-2U) |
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补水到 |
30μl |
注意:引物选择有三种情况，一是选用商品化的能与多克隆位点两边顺序结合的通用引物(如T7、T3、SP6 等)；二是使用用户自己合成的能与插入片段结合的引物（如果插入片段是PCR 产物，引物是现成的）；三是组合一种情况和第二种情况的引物。选择前两种引物在筛查到重组子后还必须用其他方法（如质粒制备后酶切或使用载体引物/插入片段引物PCR）进一步确定插入方向。选择第三种引物则可以同时完成重组子筛选和DNA 插入方向确定两项工作。用户可以根据自己的具体情况选择。
8. 将PCR 管放入PCR 仪器中进行扩增，PCR 温度参数根据引物和模板情况由客户自己预先确定。
9. PCR 结束后取10 μL 电泳直接进行琼脂糖电泳分析(注：本试剂盒提供的PCR buffer 中已经含有电泳染料和甘油，故可以直接上样。）
