（1）制备抗HRP血清：健康雄性家兔（2．Okg以上），可先于足趾皮下注射灭活的卡介苗（共lOmg），2周后重复1次，刺激机体免疫系统功能，1周后于背部脊柱两旁皮内多点注射1．Oral乳剂[福氏完全佐剂，含HRP3。3mg（RZ＝3．0）L间隔2周第2次注射，背部注入含3．3mgHRP的不完全福氏佐剂1．0ml；再间隔2周，第3次注射，2mgHRP（溶于2ml生理盐水中），分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射，1周后采静脉血，检查效价。再隔1周第4次加强注射（条件同第3次），1周后检查抗体效价，琼脂糖扩散法（HRP0．1mg／m1）为1：128以上时，颈动脉取血，制备血清低温保存备用。
（2）制备PAP复合物：离体条件下，使兔抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物。在制备抗HRP血清时，HRP的纯度要高（RZ≥3），而制备PAP复合物时，HRP的质量要求不高，甚至可用酶的粗制品。主要步骤如下：
①取HRP血清，力D7．6ml含7．6mgHRP（1。0mg／m1）的水溶液。
②混匀，室温1h后，4℃环境下离心16000r15min。
③0．9％NaCI（冷盐水）溶解沉淀，4℃环境下离心16000r15min，重复4次。
④加15．3mlHRP水溶液，在室温下持续搅拌。
⑤用lmol／L及0．1mol／lHCl调pH至2．3，当沉淀物全部溶解变清，立即用lmol／LNaOH调pH至7．2[1N怨（mol／L×离子价数）]。
⑥慢慢加入等体积的饱和硫酸铵，0℃环境下放置45min。
⑦离心35000r0℃15min，沉淀用50％硫酸铵漂洗两次。
⑧用10．5ml水溶解沉淀，对透析液[48．6gNaCl，1．5mol／I。NaOOCCH，30ml，3mol／L（NH+）280430ml，水5．94L]透析，4℃环境下离心，收集上清液，加透析液使体积至10．5ml，分装低温保存。
（3）PAP复合物的质量鉴定：制备的PAP复合物应检测酶和抗体的含量，以鉴定PAP复合物的质量。常用分光光度计检测PAP的复合物在280nm（1gG的最大吸收波长）和400nm（HRP的最大吸收波长）的光密度值（OD值），按下式计算IgG和HRP的含量。
一般HRP／抗HRP的克分子比达1．9时，可分装冷藏于一85’C冰箱。由于稀释后的PAP复合物不稳定，4℃环境下只能保存2～3周。因此，最好临用前配制。
（4）PAP复合物的特征：PAP复合物的形成不同于其他抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物，仅残留少许游离的HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的PAP复合物其HRP与抗HRP之比绝大部分为3；2。应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：PAP复合物沉降系数为11．5s，分子量为400—430kD，由此可推算出酶与抗体之比为3：2，即每个PAP生命物由3个HRP分子和2个抗HRP抗体组成，呈五角形结构，3个角为HRP，另两个角为抗HRP抗体。采用H2O2—DAB染色，电子显微镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构，直径平均21nm。这种结构异常稳定。据报道PAP复合物的抗HRP抗体与HRP结合常数为108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离HRP，亦不影响其稳定性。
（5）PAP染色原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第1抗体上，所不同的是PAP法将酶桥法的步骤3和步骤4合并为一步，用PAP复合物代替，即第3步用PAP复合物孵育切片，故称PAP法。PAP复合物中的抗HRP抗体和第1抗体为相同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第1抗体上。
（6）PAP染色步骤：主要步骤与酶桥法相似。
PAP法主要染色步骤
①切片准备及第1抗体孵育前处理同间接法；切片与特异性第1抗体孵育同酶桥法。
②用过量的桥抗体孵育，作用同酶桥法。
③用离体制得的PAP复合物（1：30～300稀释）孵育1～1．5h（室温），使其被桥抗体连结在第1抗体上。亦可用ALP抗ALP复合物代替。
④显色观察同间接法。
