新型冠状病毒2019-nCoV感染肺炎病例的实验室检测技术的科普

   日期:2020-02-14     来源:分析测试百科网    浏览:164    
核心提示:当下我国正处于新型冠状病毒2019-nCoV疫情发展阶段,该病毒感染主要会造成的新型的急性肺炎症状(WHO已将其名为NCOVID19),疫情已在全国范围内肆虐超过20天,对我国民生健康和经济造成极大影响。
  当下我国正处于新型冠状病毒2019-nCoV疫情发展阶段,该病毒感染主要会造成的新型的急性肺炎症状(WHO已将其名为NCOVID19),疫情已在全国范围内肆虐超过20天,对我国民生健康和经济造成极大影响。目前网上涌现多篇关于新型冠状病毒2019-nCoV实验室检测技术的文章,文章质量水平千差万别,良莠不齐,同时由于针对新型冠状病毒2019-nCoV的实验室检测技术手段受到了全国人民前所未有的关注,部分虚假、过度、错误的宣传文章对广泛民众产生了误导,甚至造成恐慌。因此,为正面宣传新型冠状病毒2019-nCoV相关的实验室检测技术,使普通民众科学地理解新型冠状病毒2019-nCoV的诊断与防控知识,引导正确的观点走向,现根据国家各部门颁发的相关指南共识对新型冠状病毒2019-nCoV感染肺炎病例的实验室检测技术进行整理和科普。

医学实验室检测

  医学实验室检测是指以提供人类疾病诊断、管理、预防和治疗或健康评估的相关信息为目的,对来自人体的标本进行临床检验,其中包含临床血液与体液检验、临床化学检验、临床免疫检验、临床微生物检验、临床细胞分子遗传学检验等内容,针对病毒类感染病例主要进行血液学检查和呼吸道病原学检测。

  一、血液学检查

  病毒感染相关的血液学检查主要包括血常规、血生化以及其他针对性的检测项目,相关指标为临床常用的病毒感染诊断指标,为疾病的辅助诊断提供依据。

  1、血常规

  血常规中的许多项具体指标都是一些常用的敏感指标,对机体内许多病理改变都有敏感反映,其中又以白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和血小板最具有诊断参考价值,许多患者在病因不明时可以做血常规检查对其进行辅助诊断。此外,血常规检查还是观察治疗效果、用药或停药、继续治疗或停止治疗、疾病复发或痊愈的常用指标。


  NCOVID19肺炎发病初期白细胞总数大部分降低或正常,淋巴细胞计数减少,单核细胞增加或正常。淋巴细胞绝对值如果小于0.8×109/L,一般建议3 d后复查血液常规变化。根据钟南山院士的最新研究发现82.1%的患者淋巴细胞减少、36.2%的患者血小板减少,总体患者中观察到白细胞减少的比例约占33.7%,严重病例白细胞、淋巴细胞减少、血小板减少明显。

  2、血生化:肝酶、心肌酶、乳酸脱氢酶、肌红蛋白、肌钙蛋白

  血生化是检测存在于血液中的各种离子、糖类、脂类、蛋白质以及各种酶、激素和机体的多种代谢产物的含量,可以为医生提供诊断与治疗依据,并能帮助临床确定病情、监测治疗效果。


  NCOVID19肺炎部分患者出现肝酶、心肌酶、乳酸脱氢酶、血沉和肌红蛋白增高,部分危重者可见肌钙蛋白增高。

  3、其他检测项目:C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、D-二聚体、血沉、凝血像、血气分析、乳酸等

  针对感染性疾病临床上常采用各种针对性的检测项目进行辅助诊断,为医生提供诊断与治疗依据。

  CRP和PCT的检测对鉴别是否合并肺部的细菌感染有一定价值,多数NCOVID19患者CRP和血沉升高,重症患者D-二聚体明显升高,同时出现凝血功能的障碍,外周血管的微血栓形成。此外,血气分析有助于判断重症患者的氧合情况,结合乳酸的升高可以筛查高危的氧合障碍患者

  二、CT医学影像检查

  CT是用X线束对人体某部一定厚度的层面进行扫描,由探测器接收透过该层面的X线,转变为可见光后,由光电转换变为电信号,再经模拟/数字转换器(analog/digitalconverter)转为数字,输入计算机处理。

  新冠病毒CT的影像学表现与很多其他病毒性肺炎,如流感、呼吸道合胞病毒、腺病毒感染等比较类似,很难做鉴别性诊断。CT(电子计算机断层扫描)作为临床影像学筛查指标具有重要价值,另外无论从早期诊断、鉴别诊断、排除诊断还是最终确诊等方面都还具有一定的局限性,更无法替代病原学诊断。因此,目前的技术水平下,最终的确诊还是要靠试剂盒核酸检测。

  三、呼吸道病原学检测

  呼吸道病原学检测是指采用医学检测技术手段针对进入人体的呼吸道病原体进行检测,其目的是确定呼吸道病原体感染的发生和性质,在疾病早期提供恰当的治疗方案,并采取有效的预防措施,防止感染传播造成的危害。

  呼吸道病原学检测均为病原体的针对性检测,医学上在使用某种针对性检测项目做临床诊断时常用敏感性(Sensitivity)和特异性(Specificity)来衡量检测项目的准确度和有效性。因此我们在这里先把敏感性和特异性的概念及其影响讲清楚。


  如图所示,试验指各类检测项目,在评价某种检测项目鉴别区分病例组(阳性病例)和非病例组(阴性病例)的能力时,将病例的真实情况作为横坐标,检测项目得出的检测结果作为纵坐标,真实情况与检测结果一致时检测结果为真,不一致时检测结果为假。由此引申出敏感性和特异性等概念如下:

  A.敏感性(具有该特性的对象被预知的可能性大小)=真阳性率=a/a+c;

  B.特异性(对象所具有的特殊属性的程度)=真阴性率=d/b+d;

  C.漏诊率=1-敏感性=c/a+c;

  D.误诊率=1-特异性=b/b+d

  此外,最重要的是可以借由上图分析敏感性与特异性的关系:

  A. 高敏感性→上述a增大→L线下移,无限接近X轴→c、d越来越小,b越来越大,即低漏诊率,高误诊率和低特异性(低真阴性率)。

  B. 高特异性→上述d增大→L线上移,无限接近+∞→a、b越来越小,c越来越大,即高漏诊率,低误诊率和低敏感性(低真阳性率)。

  由此可见,高敏感性与高特异性不可兼得,高敏感性则低特异性,高特异性则低敏感性。可采用敏感性高与特异性高的不同检测方法相结合的方式提高整体检测的准确度。

  接下来我们向大家介绍病原学检测的各种技术方法:

  1、病毒培养分离与鉴定

  病毒培养一般有细胞培养和鸡胚培养(9-11日龄鸡胚)这两种方法。从呼吸道标本培养分离出的病毒进行鉴定常作为呼吸道病原体实验室诊断的金标准,其敏感性和特异性均在90%以上,但多数病毒培养比较困难,技术难度高且操作复杂,生物安全条件要求高,检测周期长,一般不应用于临床检测。


  国家卫健委发布的《流行性感冒诊疗方案(2019年版)》指出“从呼吸道标本培养分离出流感病毒是流感诊断的金标准。但由于病毒培养周期较长,生物安全条件要求高,不建议应用于临床诊疗”。无独有偶,在目前公布的各项新型冠状病毒2019-nCoV防治诊疗指南中均未把病毒培养分离与鉴定列入病原学检测项目。

  2、病毒抗原检测

  病毒的结构一般由外层的衣壳蛋白包含病毒核酸物质组成,一般来说病毒的衣壳蛋白可作为病毒抗原(Virus antigen)通过病毒抗原检测技术被检测到。病毒抗原检测技术主要采用免疫层析技术,利用具有高度特异的单克隆抗体来识别呼吸道标本中的病毒抗原,待测样本中如有相对应的抗原,与试剂板中包被的抗体结合,抗体上面标记的物质呈现颜色变化,出现对应条带,通过观察条带可以得到相关的检测结果。抗体标记物一般为胶体金、乳胶颗粒和量子点荧光纳米微球等材料。这个方法在临床应用中操作简便,速度快,10-15分钟就可获得检测结果,可以做床旁检测。病毒感染人体后一般会经历一段时间的“潜伏”进行病毒复制,随后病毒大量排出引发病理反应。病毒抗原检测标本一般为上呼吸道标本,一般采用口咽拭子或鼻咽拭子进行取样,在发病初期具有良好的检测效果,但随病情的发展和治疗其检测阳性率有所下降。


  目前临床上应用最广泛的病毒抗原快速检测技术是针对流行性感冒的检测,全国有超过10家厂家可生产针对流感病毒抗原快速检测的试剂。流感抗原检测的靶标一般是流感病毒NP和MP蛋白,可以确定病毒是甲型还是乙型,但无法确定病毒的亚型。流感病毒抗原检测一般采用胶体金标记,也有采用荧光标记法进行标记的,荧光标记法会比胶体金标记的方法敏感性更高,多需相应仪器,如荧光显微镜,荧光检测设备。流感病毒抗原检测试剂的敏感性受到抗体原料和标记物性能的影响极大,使不同厂家检测试剂的敏感性跨度较大,一般在20%-70%之间,并且在病毒载量较低时无法检测到目标病毒,检测阴性不能作为排除流感感染的诊断标准,各厂家流感抗原检测试剂的特异性一般在90%以上,因此检测阳性支持诊断。在国家卫健委发布的《流行性感冒诊疗方案(2019年版)》中推荐流感病毒抗原检测可作为确诊方法,但同时也提示其检测阴性不能排除流感。抗原检测方法因其快速方便,特异性好,比较容易在各层级医院中普及。

  反观针对新型冠状病毒2019-nCoV抗原的检测则尚处于前期研发阶段,尚无有注册申报的产品出来,究其主要原因应与试剂原材料有关,主要是目前尚无法获得针对新型冠状病毒2019-nCoV抗原蛋白特异性高的单克隆抗体。尽管早在2020年1月底就有公司声称获得了新型冠状病毒2019-nCoV抗原蛋白的抗体,至今也有数家公司宣布可对外提供相应抗体,但通过查询相关信息并进行深入分析可得知目前可提供的新型冠状病毒2019-nCoV抗原蛋白抗体应均为通过动物免疫获得的多抗而并非单克隆抗体,如采用多抗作为原料生产新型冠状病毒2019-nCoV抗原检测试剂则会对试剂检测结果造成极大影响。即使经过一段时间的研发和生产有公司可提供针对新型冠状病毒2019-nCoV抗原蛋白的单克隆抗体,其作为原材料加入到抗原检测试剂中的效果仍需要大批临床实验数据的验证。然而流感病毒在全球范围内肆虐百年,并且每年有周期性的流行,国内外能够生产流感病毒抗原单克隆抗体的厂家超过百家,因此生产抗原检测试剂的厂家可以获得性能较好的单克隆抗体原材料进行研发和生产,最终获得流感病毒抗原检测试剂。综上所述,新型冠状病毒2019-nCoV抗原检测试剂尚有很长的一段路要走,但一旦试剂研发成功并获得国家药监局的注册审批则完全可以快速应用到临床,以其操作简单、检测速度快、特异性高、易普及等优点会快速被各层级医疗机构广泛接受。

  3、病毒抗体检测

  抗体(Antibody)是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质,是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌,被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质,仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中,及其B细胞的细胞膜表面。抗体是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig),由四条多肽链组成,各肽链之间由数量不等的链间二硫键连接,大致可分为5类,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。人体在接触外来抗原(Antigen)的时候,最早产生的抗体是IgM,是由B细胞表面受体直接分泌,产生IgM的B细胞进入淋巴结,在发生中心接受T细胞和抗原提呈细胞的刺激,进一步成熟,分化为浆细胞,大量产生IgG。

  目前临床上针对抗体的检测一般也采用前面抗原检测中提到的免疫层析技术,但检测试剂原料与抗原检测不同,抗体检测是利用病毒抗原蛋白来识别血液标本中的病毒由病毒感染所产生的抗体,一般针对血液中病毒特异性的IgM和IgG进行检测。


  IgM是初次体液免疫应答中最早出现的抗体,IgG是血清和体液中含量最高的抗体,占血清总Ig的75%~80%,其亲和力高,在体内分布广泛。抗体检测的方法,之前应用的比较多,但随着我们认知的逐渐提高,在2019年的流感诊疗方案中已经很明确流感病毒IgG 抗体水平恢复期比急性期呈4 倍或以上升高仅有回顾性诊断意义,无法用于病毒感染的诊断,而IgM 抗体检测敏感性较低,不建议常规使用。其实不仅是不适合流感的诊断,大多数呼吸道病毒都不需要这种抗体检测方法,其主要原因是抗体一般在患者恢复期才大量产生,时效性差,无法作为病毒感染的早期诊断,对传染性极高新型冠状病毒2019-nCoV的诊断和防控毫无意义。因此,目前各项新型冠状病毒2019-nCoV防治诊疗指南中均未把病毒抗体检测列入病原学检测项目。

  4、病毒核酸检测

  所有生物除朊病毒外都含有核酸,核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),新型冠状病毒是一种仅含有RNA的病毒,病毒中特异性RNA序列是区分该病毒与其它病原体的标志物。新型冠状病毒2019-nCoV出现后,我国科学家在极短的时间里完成了对新型冠状病毒2019-nCoV全基因组序列的解析,并通过与其它物种的基因组序列对比,发现了新型冠状病毒2019-nCoV中的特异核酸序列。临床实验室检测过程中,如果能在患者样本中检测到新型冠状病毒2019-nCoV的特异核酸序列,应提示该患者可能被新型冠状病毒2019-nCoV感染。

  检测新型冠状病毒2019-nCoV特异核酸序列的方法最常见的是荧光定量PCR(聚合酶链式反应)。因PCR反应模板仅为DNA,而新型冠状病毒2019-nCoV为RNA病毒,因此在进行PCR反应前,应将新型冠状病毒核酸(RNA)逆转录为DNA。在PCR反应体系中,包含一对特异性引物以及一个探针,该探针为一段特异性寡核苷酸序列,两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;如反应体系存在靶序列,PCR反应时探针与模板结合,DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解,报告基团与淬灭基团分离,发出荧光。每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关,病毒核酸浓度越高,Ct值越小。


  核酸检测是分子诊断的主要技术手段,是当前临床病原微生物诊断技术的前沿,是肺部感染诊断技术的发展方向,该方法的敏感性超过90%,特异性更是接近100%,目前已经在临床上被广泛用于各种呼吸道病原体的确诊检测。国家卫健委发布的《流行性感冒诊疗方案(2019年版)》中指出“:病毒核酸检测的敏感性和特异性很高,且能区分病毒类型和亚型。目前主要包括实时荧光定量PCR 和快速多重PCR。荧光定量PCR 法可检测呼吸道标本(鼻拭子、咽拭子、鼻咽或气管抽取物、痰)中的流感病毒核酸,且可区分流感病毒亚型。” 在目前公布的各项新型冠状病毒2019-nCoV防治诊疗指南中均把呼吸道或血液标本中的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测阳性定为确诊方法。

  但随着新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂的广泛投入使用,越来越多的问题暴露出来,其中最引人注意的是病毒核酸检测出现过多假阴性的问题,敏感性超过90%核酸检测试剂为何存在较多的假阴性结果,我们针对此问题也整理了相关资料并在此进行详细描述。总体上讲核酸检测的结果受到疾病发展过程、标本采集、标本保存与运输、核酸提取、扩增体系、检测操作环境以及人员操作等因素的影响。

  5、病原学检测方法的选择:

  由于新型冠状病毒2019-nCoV的临床研究有限,因此我们参考流感检测时间窗口明确当前新冠病毒2019-nCoV的实验室检测方法的选择。根据流感检测的时间窗口我们可以看到比如POCT、荧光检测技术、病毒分离培养法、RT-PCR、抗体检测等方法,它们检测的时间和时间段有所不同,病毒抗原检测(以POCT或荧光检测技术开展),病毒分离培养法和核酸检测(以RT-PCR技术开展)的检测窗口靠前,抗体检测滞后。呼吸道病毒诊断做抗体检测或者培养在临床诊断中价值不高,前者影响因素太多(如产生抗体的时间窗较长,受人体自身免疫状况影响较大),后者很难满足即时检测的需求。因此在各项指南和共识中指出目前临床上针对流感病毒的病原学检测集中于抗原检测和核酸检测两项,而针对新型冠状病毒2019-nCoV的病原学检测仅限于核酸检测。

  四、总结

  针对上文论述,我们总结了不同方法学的差异:

  引用指南包括:

  中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版修正版)》、《新型冠状病毒肺炎防控方案(第四版)》、《WS 286-2008 传染性非典型肺炎诊断标准》、《流行性感冒诊疗方案(2019年版)》

  武汉大学中南医院新型冠状病毒感染的肺炎防治课题组发布的《新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的肺炎诊疗快速建议指南(标准版)》

  华中科技大学同济医学院附属同济医院救治医疗专家组发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗快速指南(第三版)》

  北京协和医院发布的《关于“新型冠状病毒感染的肺炎”诊疗建议方案(V2.0)》

  中华医学会儿科学分会呼吸学组呼吸道感染协作组发布的《儿童呼吸道感染微生物检验标本采集转运与检测建议(病毒篇)》

  说明:主要以国家卫健委出台的方案为准,武汉和北京医院的方案与国家卫健委方案不冲突,作为辅助参考,鉴于新型冠状病毒2019-nCoV属于新型病毒,其相关的各项研究均属于早期阶段,缺少大量临床数据支撑,故部分检测方案数据参考国家卫健委发布的SARS肺炎诊断标准和流感诊断方案。

 
日期: 2020-02-14
标签: 新型冠状病毒
 
相关资讯
免责声明
1.本网中刊登的文章、数据的版权仅归原作者所有,原创文章由中实仪信网编辑整合,转载请注明中实仪信网出处。
2.转载其它媒体的文章,我们会尽可能注明出处,但不排除来源不明的情况。网站刊登文章是出于传递更多信息的目的,对文中陈述、观 点判断保持中立,并不意味赞同其观点或证实其描述。
3.如您对文章内容、版权或其他问题持有异议,请与中实仪信网联系。联系邮箱:office@anmiya.com 联系QQ:

推荐图文
推荐资讯
点击排行
新手指南
采购商服务
供应商服务
交易安全
关注我们
中实仪信会员交流群

0535-6611163

周一至周五 9:00-18:00
(其他时间联系在线客服)

24小时在线客服