BTN60906 cDNA一链合成试剂盒说明书

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BTN60906 cDNA一链合成试剂盒说明书

产品编号:BTN60906

规格:10T/50T

产品及特点

本试剂盒提供合成cDNA 一链所需要的全部试剂。其原理是用突变的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶(M-MμLV RT)高效合成mRNA 的全长cDNA 拷贝。

1. 使用突变的反转录酶,内源RNase H 活性低。

2. zui长可合成13 Kb 的cDNA。

3.可以使用oligo-dT、随机引物和RNA 专一性引物三种引物(前两种本试剂盒提供)。

4.总RNA、poly(A)+RNA 或特殊RNA 均可作为模板。

5.可用于cDNA 文库构建、RT-PCR、探针标记等。

规格及成分:

成分

规格

MMLV(含RI)

100μl

RT Buffer(含dNTP)

250μl

Oligo(dT)18引物(0.5μg/μL)

50μl

随机引物(0.2μg/μL)

50μl

RNase-free水

1ml

说明书

1份

保存条件:

低温运输,-20℃保存,有效期一年。

使用方法:

一:合成PCR 用的1st-strand cDNA

1. 按下表配制RT 反应体系:

RNA

 

总RNA

100-500ng

或poly(A)mRNA

10-500ng

或专一的RNA

0.01pg-500ng

注意:RNA 样品不能含有基因组DNA 污染。

引物

Oligo (dT)18(0.5μg/μL)

1μl

或随机引物(0.2μg/μL)

1μl

或RNA板专一性引物

15-20 pmol

注意:随机引物与RNA板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。

RNase-free水

补水到13μL

2. 70℃保温5分钟后立即冰浴。

3. 再加入5 μL RT Buffer(dNTP)。

4. 37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA模板,可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物,则改成25℃ 5分钟。

5. 加入2 μL MMLV 逆转录酶(RI),反应终体积为20 μL。

6. 42℃保温60分钟(但如果使用随机引物,需要先25℃保温10分钟,然后再转移到42℃保温60分钟)。此步为RT 反应。

7. 70℃保温10分钟以终止反应,然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用,不需要纯化。

二:合成建文库用的1st-strand cDNA

1. 按下表配制RT 反应体系:

RNA模板

 

poly(A)mRNA

1μg

或专一的RNA

0.5-1μg

注意:RNA样品不能含有基因组DNA 污染。

引物

 

Oligo(dT)18(0.5μg/μL)

1μl

或随机引物(0.2μg/μL)

1μl

或RNA模板专一性引物

100 pmol

注意:随机引物于RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。

RNase-free水

补水到13μL

2. 70℃保温5分钟后立即冰浴。

3. 再加入5 μL RT Buffer(dNTP)。

4. 37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA模板,可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物,则改成25℃ 5分钟)。

5. 加入2 μL MMLV 逆转录酶(RI),反应终体积为20μL。

6. 42℃保温60分钟(但如果使用随机引物,需要先25℃保温10分钟,然后再转移到42℃保温60分钟)。此步为RT 反应。

7. 70℃保温10分钟以终止反应,放置在冰上待用。合成的cDNA可以用于第二链cDNA 的合成或放置在-20℃长期保存。

三:用对照模板合成cDNA

1. 按下表配制RT 反应体系:

对照RNA模板(0.5μg/μL)

2μl

引物

 

Oligo(dT)18(0.5μg/μL)

1μl

或随机引物(0.2μg/μL)

1μl

或对照专用引物

2μl

RNase-free水

补水到13μl

2. 70℃保温5分钟后立即冰浴。

3. 再加入5 μL RT Buffer(含标记dNTP,本试剂不提供)。

4. 37℃保温5分钟。如果使用随机引物,则保温温度只能是25℃。

5. 加入2 μL MMLV 逆转录酶(RI),反应终体积为20μL。

6. 42℃保温60分钟(但如果使用随机引物,需要先25℃保温10分钟,然后再转移到42℃保温60分钟)。

7. 加1μL 0.5M EDTA,放置在冰上待用。

8. 电泳检测。合成的cDNA 的量一般有加入RNA 总量的50%以上,电泳一般能出现1.1Kb 的片段(如果使用随机引物,将出现多个小片段)。

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日期: 2019-08-14
标签: 试剂盒 产品 特点 病毒
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