人甲壳质酶蛋白 40(YKL-40)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书

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  人甲壳质酶蛋白 40(YKL-40酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书

       本试剂仅供研究使用 目的:本试剂盒用于测定人血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中甲壳质酶蛋白 40(YKL-40)的含量。

       实验原理:

       本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人甲壳质酶蛋白 40(YKL-40)水平。用纯化的人甲壳质酶蛋白 40(YKL-40)捕获抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被的微孔中依次加入人甲壳质酶蛋白 40(YKL-40),再与 HRP 标记的检测抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的人甲壳质酶蛋白 40(YKL-40)呈正相关。

       用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度(OD 值),通过标准曲线计算样品中人甲壳质酶蛋白 40(YKL-40)含量。

       试剂盒组成:

       试剂盒组成 48 孔配置 96 孔配置 保存

       说明书 1 份 1 份

       封板膜 2 片 2 片

       密封袋 1 个 1 个

       酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存

       标准品 0.3ml×6 管 0.3ml×6 管 2-8℃保存

       酶标试剂 5 ml×1 瓶 10 ml×1 瓶 2-8℃保存

       样品稀释液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

       显色剂 A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

       显色剂 B 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

       终止液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

       20×浓缩洗涤液 15ml×1 瓶 25ml×1 瓶 2-8℃保存

       注:标准品浓度依次为:64、32、16、8、4、0 ng/mL.

       样本处理及要求:

       1. 血清:室温血液自然凝固 10-20 分钟,离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。

       2. 血浆:应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合 10-20 分钟后,离心20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。

       3. 尿液:用无菌管收集,离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

       4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心 20 分钟左右(2000-3000 转2/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用 PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

       5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的 PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。

       6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。

       7. 不能检测含 NaN3 的样品,因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

       操作步骤:

       1. 标准品的加样:设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL;。

       2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl,然后再加待测样品 10μl(样品zui终稀释度为 5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

       3. 加酶:每孔加入酶标试剂 100μl,空白孔除外。

       4. 温育:用封板膜封板后置 37℃温育 60 分钟。

       5. 配液:将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用。

       6. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置 30 秒后弃去,如此重复 5 次,拍干。

       7. 显色:每孔先加入显色剂 A50μl,再加入显色剂 B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色 15 分钟.

       8. 终止:每孔加终止液 50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

       9. 测定:以空白孔调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。

      注意事项:

       1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。

       2. 浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。

       3. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间zui好控制在 5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

       4. 请每次测定的同时做标准曲线,zui好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本 OD 值大于标准品孔第yi孔的 OD 值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n 倍)后再测定,计算时请zui后乘以总稀释倍数(×n×5)。

       5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

       6. 底物请避光保存。

       7. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

       8. 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

       9. 本试剂不同批号组分不得混用。

       10. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准。计算:

       以标准物的浓度为横坐标,OD 值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的 OD 值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

       试剂盒性能:

       1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.95 以上。

       2.批内变异系数与批间变异系数应分别小于 10%和 15% 。

       检测范围:

       2 ng/mL - 64 ng/mL

       灵敏度:

       zui低检测浓度小于 0.1 ng/mL

       保存条件及有效期:

       1.试剂盒保存: 2-8℃。

       2.有效期: 6 个月

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标签: 人甲壳质酶蛋白 40 蛋白 YKL-40 酶联免疫 酶联免疫分析 ELISA
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