肉制品中亚硝酸盐的测定有离子色谱法和盐酸禁乙二胺比色法两种国家标准方法。本实训采用盐酸萘乙二胺比色法(依据GB5009.33-2010《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定》第二法)。
1.目的要求
(1)学习盐酸禁乙二胺比色法测定肉制品中亚硝酸盐含量的原理和操作方法。
(2)掌握样品的制备、提取等基本操作技能。
(3)掌握分光光度计的使用方法和操作技能。
2.实训原理
试样经沉淀蛋白质和除脂后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，然后再与盐酸萘乙二胺耦合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。
3.实训用品
(1)分析天平。
(2)食物粉碎机。
(3)分光光度计。
(4)亚铁氰化钾溶液(106g/L)：称取1060g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]，用水溶解，并稀释至1000mL。
(5)乙酸锌溶液(220g/L)：称取220.0g乙酸锌[Zn(CH3COO)2]，先加30mL冰醋酸溶解，用水稀释至1000mL。
(6)饱和硼砂溶液(50g/L)：称取5.0g硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)，溶于100mL热水中，冷却后备用。
(7)对氨基苯磺酸溶液(4g/L)：称取0.4g对氨基苯磺酸(C12H14NO3S)，溶于100mL 20%(体积分数)盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存。
(8)盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)：称取0.2g盐酸萘乙二胺(C12H14N2·2HCl)，溶于100mL水中，混匀后，置棕色瓶中，避光保存。
(9)亚硝酸钠标准溶液(200ug/mL)：准确称取0.1000g于110～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。
(10)亚硝酸钠标准使用液(5.0ug/mL)：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL，置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度。
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的二级水或去离子水。
4.安全提醒
盐酸萘乙二胺具有致癌作用，使用时要注意安全。
5.操作步骤
(1)试样的处理
①试样预处理：按照四分法取适量肉制品，用食物粉碎机制成匀浆备用。
②提取：称取5g(精确至0.01g)制成匀浆的试样(如制备过程中加水，应按加水量折算)，置于50mL烧杯中，加12.5mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300mL将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。
③提取液净化：在振荡上述提取液时加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，滤液备用。
(2)亚硝酸盐的测定吸取40.0mL上述滤液于50mL于具塞比色管中，另吸取0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00，2.50mL亚硝酸钠标准使用液(相当于0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.5，10.0，12.5ug亚硝酸钠)，分别置于50mL具塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色皿，以零管调节零点，于波长538mm处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。
6.结果计算
式中X——试样中亚硝酸钠(以亚硝酸钠计)的含量，mg/kg
m1——测定用样液中亚硝酸钠的质量，ug
m2——试样质量，g
V1——试样处理液总体积，mL
V2——测定用样液体积，mL
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
7.要点提示
(1)当亚硝酸盐含量高时，过量的亚硝酸盐可以将偶氮化合物氧化，变成黄色，而使红色消失，这时可以采取先加入试剂，然后滴加试液，从而避免亚硝酸盐过量。
(2)油脂含量高的样品需除去脂肪。可通过加热后冷却使脂肪凝固后再过滤除去，或用撇去法分开萃取上层脂肪；对有色的样品，如红烧的肉类，因其色素影响比色测定，应在硫酸锌沉淀蛋白质后，取其滤液60mL于100mL容量瓶中，加氢氧化铝乳液定容，然后过滤取其无色透明滤液进行比色测定。若一次加氢氧化铝乳液脱色效果不好，可进行两次或三次脱色过程，直至萃取液为无色透明滤液再进行比色测定。
(3)样品在沉淀蛋白质时，所用乙酸锌溶液不宜过多，否则会生成白色沉淀影响测定。
(4)滤液不要放置过久，以免亚硝酸盐发生氧化作用影响测定结果。
相关链接：护色剂的测定
文章来源：《食品理化检测技术》
