BTN51102 细菌RNA提取试剂盒说明书

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BTN51102 细菌RNA提取试剂盒说明书
 

产品编号:BTN51102

规格:100T/250T

产品及特点

本产品是在动物RNA提取试剂盒基础上根据细菌提取的具体情况改良而得。它基于异硫氰酸胍/酚/fang提取RNA原理,可用于包括E.coli、Campylobacter fetus、Pseudomonas aeruginosa、Rhodobacter sphaeroides 等各种常见的革氏阴性细菌。如果需要提革氏阳性细菌(如Bacillus subtilis、Staphylococcus aureus 等)的RNA,可以选择真菌RNA提取试剂盒。本产品特点如下:

1. 操作简单快速,只要十分钟左右,可以全在室温下进行。

2. 所得 RNA 质量高,OD260/OD280 一般在 1.9,不含基因 DNA 污染。

3. 灵敏度高,可以从一个菌落中提取到普通电泳能够检测到的总 RNA。

4. 性价比高于进口同类产品。

规格及成分:

成分

100T

250T

细菌RNA提取试剂

100ml

250ml

说明书

1份

1份

保存条件:

常温运输,4℃保存,有效期一年。

自备试剂:

fang,异丙醇,75%乙醇,RNA 溶解液。

使用方法:

1. 在 1.5 mL 塑料离心管中离心收集 0.2-1.5 mL 新鲜细菌(注意:由于细菌RNA 半衰期十分短,所以,必须使用zui新鲜细菌),吸尽液体培养基,加入1 mL细菌 RNA提取试剂盒并用枪充分吹打,确保细菌全部裂解,没有块状物。

如果使用菌落,则用接种环小心将其转移到装有1mL 细菌 RNAOUT 的1.5 m 塑料离心管中,用移液枪吹打均匀。在细菌数较少时,建议使 用助沉剂 RNADOWN 以提高 RNA 回收率。

2. 加入 0.2 mL fang,在振荡器上充分振荡混均 30 秒(必须将管底的液体振荡起来,否则不能有效将 DNA 打断和去除蛋白质)。

3. 12000-15000g室温离心3分钟。上清液无色,下层液呈篮色,中间为蛋白质。小心将上清液转移到另一干净 1.5ml塑料离心管中,上清液体积约为0.6mL。为避免触及中间层的 DNA 和蛋白质,建议分小量多次 吸取,并且只取 0.5 mL,留 0.1 mL 左右。当细菌数量较少时,中间层十分松散,上清时很容易吸到下层有机相,需要更加小心。

4. 在上清液中加入等体积的异丙醇,振荡器上振荡混均 30秒。

5. 12000-15000 室温离心 3-10 分钟,RNA 将在管底侧面形成沉淀。

6. 小心吸弃上清液,注意不要吸弃 RNA 沉淀。

7. 在离心管中加入 1mL 75%乙醇,振荡器上振荡混均 30 秒。

8. 12000-15000 g 室温离心 1 分钟。

9. 小心吸弃上清液,注意不要吸弃 RNA 沉淀。

10. 重复第 8 到第 10 步一次。

11. 短暂快速离心,用移液枪小心吸弃残留液(约 50 μL)。

12. 短暂放 1-2 分钟后加入适量 RNA 溶解液使 RNA 沉淀溶解,可以立即使用或存放于-80℃长期保存。

13. RNA 完整性的电泳检测:

如果需要做 Northern 杂交,强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳,因为非变性胶不能分离所有的RNA 分子(BioTechniques,28:414,2000)。如果是简单检测,可以使用TAE或百奥莱博的SuperBuffer-2 DNA/RNA 两用快速电泳液,但文献报道必须使用变性上样液(BioTechniques,9:558,1990)。普通 DNA 上样液不含变性剂,也没经过去 RNase 处理,所以zui好不要使用。 尤其需要注意的是不要使用TBE 进行RNA 电泳,因为TBE 所含硼酸是研究多糖的经典方法----硼酸络合法中的关键成分,硼酸通过与RNA 核糖中的羟基发生络合反应,形成RNA 分子内或RNA 分子间的络合复合物,使同样长度的RNA 具有不同的泳动速度,电泳条带弥散,同时有大的RNA 络合复合物迟留在加样孔中(一般会误以为是基因组DNA 污染)。RNA 分子内或RNA 分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸与RNA的数量比例有关,而RNA 样品中污染的其他多糖(如植物中提取的RNA)也会参与此反应,使硼酸对RNA 电泳的影响更复杂,所以TBE 对RNA 电泳的影响没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行,zui好是避免使用。

由于细菌细胞中70-80%的RNA为rRNA,后者又由23S (约 3700nt),16S (约1700 nt)和5S (约100 nt)三种组成,所以变性胶电泳后应该在UV下看见三条清晰的rRNA带。由于核酸长度与结合 EB 的数量成正比(当然还与RNA 的二级结构有关,双链部分结合能力比单链部分强),所以23S rRNA条带的荧光强度一般比16S rRNA条带的荧光强度强2倍。如果这两条rRNA 带不清晰或比例小于此范围则表示 RNA 有降解(因为大的 RNA 被酶降解的可能更大)。

14. RNA 产量产率测定:

 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度(1 OD260 的RNA=40 μg/mL),进而计算出 RNA 的产量和产率。注意不要将 RNA 稀释在 DEPC 水中检测 OD260 和 OD280,否则光吸收比在 TE 中测得的低 10%-15%,因为核酸光吸收跟溶液 pH 相关,而 DEPC 水中的DEPC 高压分解后产生的 CO2 与水反应生成碳酸,使溶液 pH 降低进而降低 RNA 的光吸收。

15. RNA 纯度测定:

无污染的总 RNA 的 OD260/OD280一般在 1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关), OD260/OD230 一般在2.0-2.3 之间,如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染,但一般不影响 RT-PCR 等反应。蛋白质污染可以通过酚/fang抽提一次然后酒精沉淀去除,DNA 和多糖污染可以分别用百奥莱博的DNAErasol和 PS Erasol去除。

疑难解答:

Q:上样孔里的红色荧光物一定是污染的基因组DNA吗?

A:不是。用 TAE 或 TBE 电泳液和非变性胶电泳 RNA 时容易产生此现象,百奥莱博初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA 通过碱基互补或通过硼酸络合(如果使用TBE作电泳液的话)形成的复合物,加 RNase处理后,这些红色荧光物一般会消失。为避免此现象,建议zui好使用甲醛变性胶电泳。如果需要使用非变性胶,也必须在上样前使RNA变性。使用我司基因优化的上样/变性/染色三用溶液 RNAON 可以使 RNA 在非变性胶上电泳时也有较好分辨率。使用非变性胶时,可以使用TAE或超快电泳液SuperBuffer-2,zui好不要使用TBE缓冲液,因为TBE中的硼酸能与RNA的多羟基形成复合物,RNA 很难形成锐利的条带。

Q:如何确认和去处除污染的基因组 DNA?

A:如果怀疑有 DNA 污染,可以用 RNase 处理 RNA 样品,然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失,则表示是基因组 DNA 污染。进一步确认可以使用 PCR 扩增法。去除污染的 DNA 可以使用非酶的 DNA 去除剂DNA Erasol 或 RNase-free DNase,由于 RNase-free DNase 一般都有残留的RNase 污染,所以必须严格按照厂家提供的使用说明书进行操作。

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日期: 2019-08-16
标签: 细菌 试剂盒 产品 特点
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