4.操作步骤
以下步骤需在避光条件下进行。
(1)样品预处理
①皂化：取适量样品，相当于原样1～5g(含胡萝卜素20～80ug)的匀浆，粮食样品视其胡萝卜素含量而定，植物油和高脂肪样品取样量不超过10g。置于100mL具塞锥形瓶中，加脱醛乙醇30mL，再加10mL氢氧化钾溶液(1+1)，回流加热30min，然后用冰水使之迅速冷却。皂化后样品用石油醚提取，直至提取液为无色为止，每次提取石油醚用量为15～25mL。
②洗涤：将皂化后样品提取液用水洗涤至中性，通过盛有10g无水硫酸钠的小漏斗，滤入球形瓶，用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液并入球形瓶内。
③浓缩与定容：将球形瓶内的提取液于旋转蒸发器上减压蒸馏，水浴温度为60℃，蒸发至约1mL时，取下球形瓶，用氮气吹干，立即加入2.00mL石油醚定容，备层析用。
(2)纸层析
①点样：在18cm×30cm的滤纸下端距底边4cm处作一基线，在基线上取A、B、C、D四点(见图3-8)，吸取0.100～0.400mL浓缩液在AB和CD间迅速点样。
②展开：待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行上行展开。
③洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放入盛有5mL石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶于溶剂中。
图3-8纸层析点样示意图
(3)测定用1cm比色杯，以石油醚调零点，于450mm波长下，测吸光度，以其值从标准曲线上查出β-胡萝卜素的含量，供计算时使用。
(4)标准工作曲线绘制取β-胡萝卜素标准使用液(浓度为50ug/mL)1.00，2.00，3.00，4.00，6.00，8.00mL，分别置于100mL具塞锥形瓶中，按样品分析步骤进行预处理和纸层析，点样体积为0.100mL，标准曲线各点含量依次为2.50，5.00，7.50，10.00，15.00，20.00u8。为测定低含量样品，可在0.00～2.50ug间加做几点，以β-胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
5.结果计算
式中x——样品中胡萝卜素的含量(以β-胡萝卜素计)，mg/100g
m1——在标准曲线上查得的胡萝卜素的含量，ug
V1——点样体积，mL
V2——样品提取液浓缩后的定容体积，mL
m——样品质量，g
计算结果保留三位有效数字，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
6.要点提示
(1)本法简单方便，色带清晰，适用于植物性食品和含有植物性食品的混合食品中胡萝卜素的测定。方法检出限为0.11ug，线性范围1～20ng。
(2)无水乙醇中不得含有醛类物质，检验方法和脱醛方法如下：
①检验方法：采用银镜反应法检验，即加浓氨水于5%硝酸银溶液中，直至氧化银沉淀溶解，加入2.5mol/L NaOH溶液数滴，如发生沉淀，再加浓氨水使之溶解。然后加2mL银氨液于试管内，加入几滴乙醇摇匀，加入少许2.5mol/L NaOH溶液加热，如乙醇中无醛，则没有银沉淀，否则有银镜反应。
②脱醛方法取2g硝酸银溶于少量水中，取4g氢氧化钠溶于温乙醇中，将两者倾入1L乙醇中，暗处放置两天(不时摇动，促进反应)，过滤，滤液倾入蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸的50mL。乙醇中含醛较多时，硝酸银用量可适当增加。
(3)通常β-胡萝卜素标准品不能完全溶解于有机溶剂中，必要时应先将标准品皂化，再用有机溶剂提取，用蒸馏水洗涤至中性后，浓缩定容，再进行标定。由于胡萝卜素很容易分解，所以每次使用前，所用标准品均需标定，在测定样品时连同标准品同步操作。
(4)浓缩提取液时，一定要防止蒸干，避免胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏。定容、点样、层析后剪样点等操作环节也一定要迅速。
文章来源：《食品理化检测技术》
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