5.操作步骤
(1)样品的制备全部操作过程应避光。
称取100g果蔬鲜样及吸取100ml.20g/L草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取10～40g匀浆(含1～2mg抗坏血酸)倒入100mL容量瓶中，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，混匀，过滤(不易过滤的样品可用离心机离心后，倾出上清液后过滤)，滤液备用。
(2)氧化处理取25mL上述滤液，加入2g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10.00mL此氧化提取液，加入10mL 20g/L硫脲溶液，混匀，即为样品稀释液。
(3)呈色反应
①于三个试管中各加入4mL上述样品稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中各加入1.0mL 20g/L 2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入(37±0.5)℃恒温箱或恒温水浴中，保温3h。
②3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0mL 20g/L 2，4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置10～15min后放入冰水内，其余步骤同样品。
(4)硫酸(9+1)处理当试管放入冰水后，向每一试管中加入5mL硫酸(9+1)，边加边摇动试管，滴加时间至少需要1min。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。
(5)比色用1cm比色杯，以空白液调零点，于520nm波长测吸光值。
(6)标准曲线的绘制
①加2g活性炭于50mL标准溶液中，振摇lmin，过滤。
②取10mL滤液放入500mL容量瓶中，加入5.0g硫脲，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度为20ug/mL。
③取5，10，20，25，40，50，60mL稀释液，分别放入7个100mL容量瓶中，用10g/L硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2.4，5，8，10，12ug/mL。
④按样品测定步骤进行显色反应，形成并比色。
⑤以吸光度为纵坐标，抗坏血酸浓度(ug/mL)为横坐标绘制标准曲线。
6.结果计算
式中x——样品中总抗坏血酸含量，mg/100g
p——由标准曲线查得或由回归方程算得“样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度，ug/mL
V——样品用10g/L草酸溶液定容的体积，mL
F——样品氧化处理过程中的稀释倍数
m——样品的质量，g
计算结果表示到小数点后两位，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
7.要点提示
(1)活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧进行界面反应，加入量过低，氧化不充分，测定结果偏低；加入量过高，对抗坏血酸有吸附作用，使结果也偏低。
(2)活性炭在使用前需要进行酸洗和水洗，以除去铁离子。
处理方法：将100g活性炭加到750mL 1mol/L盐酸中，回流1～2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子(Fe3+)为止，然后置于110℃烘箱中烘干备用。
检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将20g/L亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。
(3)因维生素C自身的不稳定，导致了很多方法测定结果误差较大。本法加入硫脲可以防止抗坏血酸继续氧化，同时促进胨的形成。加入硫脲时应直接垂直滴入溶液，不能滴在管壁上，防止溶液中硫脲的浓度不一致，影响测定结果。
(4)加入硫酸(9+1)溶解形成的滕时，应边滴加边振摇试管，防止样品中糖类成分炭化而使溶液变黑，影响吸光度的测定。
(5)试管从冰浴中取出后，因糖类的存在造成显色不稳定，颜色会逐渐加深，30min后影响将减少，因此，在加入硫酸30min后准时比色。
文章来源：《食品理化检测技术》
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