维生素D的测定方法主要有比色法、紫外分光光度法、气相色谱法、液相色谱法及薄层层析法等。被AOAC选为正式方法的是比色法和高效液相色谱法。这里介绍用高效液相色谱法测定食品中的维生素D。
1.原理
试样经皂化后，用苯提取不皂化物，馏去苯后，使用第一阶段的分取型HPLC，分取维生素D组分，以去除大部分干扰物质。得到的维生素D组分，用于第二阶段分析型HPLC，得样品色谱图，与按同样操作条件得到的维生素D标准品的色谱图比较进行定量。
2.操作步骤
(1)样品的皂化及不皂化物的提取称取粉碎的样品1～10g(维生素D含量在2IU以下)置于皂化瓶中，加入40mL 10%焦性没食子酸-乙醇溶液及10mL 0.9g/mL KOH溶液，装上回流装置，在沸水浴上皂化30min，然后用流动冷水冷却至室温，准确加入100mL苯，塞上瓶塞，激烈振混15s，然后移入200～250mL分液漏斗中(如有沉淀物就留在烧瓶中，此时不需要用苯洗皂化瓶)，加入1mol/L KOH溶液50mL，振混后静置，弃去水层。再加0.5mol/L KOH溶液50mL，振混后静置，弃去水层。再每次用50mL水洗涤苯层数次。直至用酚酞检验时洗液不呈碱性为止。分液漏斗静止几分钟，直至最后一滴水分离，弃去水。
(2)维生素D的分取准确吸取上述苯溶液80mL于圆底烧瓶内，在40℃以下的温度减压蒸去苯，所得残留物中准确加入5mL正己烷使之溶解，取4.5mL置于10mL具塞试管内，减压蒸去溶剂，残留物中准确加入乙腈-甲醇(1：1)溶液500uL使之溶解。准确吸取该溶液200uL注入分取用色谱柱中。事先用标准维生素D确定其溶出位置，用馏分收集器收集维生素D组分(本实验色谱条件下维生素D保留时间为17～18min，收集其16～19min溶出的组分)。
(3)维生素D的定量减压蒸馏维生素D组分中的溶剂，残留物溶解在200uL的0.4%异丙酮-正己烷溶液中，取其中100uL注入分析用色谱柱中，得样品色谱图。
取维生素D标准液1mL，按上述步骤(1)～(3)操作，得标准维生素D色谱图。
3.结果计算
式中x——维生素D的含量，IU/100g
hsa——样品色谱图中维生素D的峰高或面积
hst——标准溶液色谱图中维生素D的峰高或面积
c——维生素D标准溶液的浓度，IU/mL
m——样品质量，g
4.要点提示
(1)分取的维生素D应在半日内更换柱子后测定，如超过半日应封入惰性气体冷冻保存、再改换柱子测定。本法对维生素D2和维生素D3不加区别，两者混合存在时，以总维生素D定量。
(2)水洗苯提取的不皂化物时，为防止因形成胶粒而在水中损失，用1mol/L KOH溶液、0.5mol/L KOH溶液及水洗，使碱的浓度逐渐降低。
(3)加入焦性没食子酸是作为抗氧化剂。
文章来源：《食品理化检测技术》
